氢氧化钠固态预处理对稻草中木素结构特性的影响

摘要：通过氢氧化钠（NaOH）固态预处理可以显著提高稻草厌氧消化产气量。为探明这种处理方式对稻草产气量影响的内在机理，采用傅立叶变换红外光谱（FTIR）、氢质子核磁共振波谱（1HNMR）、凝胶渗透色谱（GPC）等方法，对NaOH固态处理前后稻草中木素结构的变化进行了多方位研究。结果表明，NaOH固态预处理使稻草中木素内部结构、木素-碳水化合物复合体的形态结构发生了明显的变化，使得纤维素从木素的包裹中释放出来，木素成分也由难降解的三维网状大分子转变成了易降解的直链结构的小分子，从而使得厌氧微生物能够接触到更多的纤维素和对其进行更有效的消化。这些木素形态结构的变化是导致稻草厌氧消化产气量提高的内在原因。
关键词： 稻草；固态预处理；氢氧化钠；木素；结构变化

Effect of sodium hydroxide solid-state pretreatment on property of lignin structure of rice straw
HE Yanfeng, LI Xiujin*, FANG Wenjie, KANG Jiali
Department of Environmental Science and Engineering, Beijing University of Chemical Technology，Beijing 100029

Abstract: Anaerobic digestion biogas yield of rice straw could be increased obviously through sodium hydroxide (NaOH) solid-state pretreatment. This study was conducted to investigate the mechanism of biogas yield improvement of the pretreated rice straw. Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR), Hydrogen-1 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (1HNMR), and Gas Permeation Chromatography (GPC) were used to analyze the changes of lignin structure of the rice straw pretreated by NaOH from different angels. The results showed that the internal structures of lignin and lignin-carbohydrate complex (LCC) were greatly altered after NaOH pretreatment, resulting in the separation of cellulose from lignin and the decomposition of lignin from large molecules with three-dimension network structure to small molecules with linear structure. The changes made the compositions of the pretreated rice straw more available to and more easily to be digested by anaerobic micro-organisms as compared to
raw rice straw, leading to the improvement of biodegradability and the increase of biogas yield of the pretreated rice straw.
Key Words: rice straw；solid-state pretreatment; sodium hydroxide; lignin；structural change

我国是世界上最大的农业国家，年产各类作物秸秆7亿吨左右，其所含有的能量折合3.53亿吨标准煤(任仲杰等，2005)。利用厌氧消化技术把秸秆转化成清洁能源—生物气（Biogas）是秸秆资源化利用的有效途径。但是，由于秸秆中的木质纤维素含量较高，厌氧消化效率低、产气量少，从而限制了秸秆用于生物气的大规模生产应用。
通过预处理可以提高秸秆的厌氧消化性能和产气量。以碱处理为代表的化学处理是比较简单、有效的预处理方法。吴江等（2006）采用NaOH溶液对稻草进行浸泡预处理，发现稻草厌氧消化产气量提高了38%-119%。Ghosh等（1999）发现，在室温条件下添加1%浓度的氢氧化钠溶液对麦秸进行处理后，麦秸的可生物降解性能得到了明显提高。目前，碱处理主要使用的是氢氧化钠溶液浸泡（也称“液态处理”），它的处理效果很好，但是，液态处理需要专门的预处理反应器，投资大，处理要求也高；更重要的是，液态处理会产生残余碱液，需要进行回收处理，若处理不好，会对环境造成严重的二次污染。为解决此问题，本研究所在课题组提出了NaOH固态预处理新方法，并进行了比较深入的研究（Yang，2003；Luo，2005）。固态化学预处理采用少量氢氧化钠溶液与秸秆混合，秸秆含水率控制在100%以下，秸秆处于湿润、无流动水的状态。这种固态处理方法操作简单、无废碱液，不仅可节约设备投资和处理成本，对环境也不会产生任何污染。

我们的前期研究发现，NaOH固态预处理可使秸秆的产气量提高50%以上，并且，由于上述优点，该法已被用于实际生产中。但是，这种表象的内在原因一直尚不清楚，国内外也都未见相关报道。秸秆中木素含量虽然只占13%-25%，但却是限制秸秆快速降解的关键因素（史央等，2004）。本研究通过傅立叶变换红外光谱（FTIR）、氢质子核磁共振波谱（1HNMR）、凝胶渗透色谱（GPC）等方法，从多方位对NaOH固态预处理秸秆过程中木素形态结构的变化进行了研究，包括木素的功能基、木素结构单元的形式以及结构单元之间的联接方式等的变化，以探明稻草产气量提高的内在原因，为深入认识微观世界和进一步研究奠定基础。

2 实验材料与方法(Materials and methods)
2.1 实验材料
本研究所用实验材料为取自北京通县次渠镇的稻草。实验前先用裁刀将自然干燥的稻草截成1cm长的小段，再用球磨粉碎机粉碎后备用。
2.2 实验方法
2.2.1 原料的氢氧化钠固态预处理我们的前期实验发现，经6%（相对于稻草的干重）NaOH预处理过的稻草其厌氧消化产气量和经济性最好，因此本实验中氢氧化钠添加量为6%。实验时先将18g氢氧化钠固体溶于240ml水中，配成氢氧化钠溶液，然后与粉碎的300g稻草充分混合均匀，混合后为潮湿状态，然后充满压实到烧杯中。常温下固态保存30天后出料，最后在105℃的烘箱中烘干至恒重后备用。
2.2.2 磨木木素（MWL）的制备从植物纤维原料中提取木素的方法很多，按照Björkman（1956）的方法制得的木素称为磨木木素。由于其在制备过程中发生的化学变化较少，认为是与原本木素最为接近的木素，因而得到普遍使用。称取100g研磨后的未处理与经6％NaOH处理后的稻草粉末，常温下用500ml二氧六环与水（8：2）的混合溶剂抽提48h。过滤抽提液，反复抽提3次，以保证将稻草中的可溶性物质和MWL全部提出。合并后的抽提液于40℃及真空的条件下，用旋转蒸发器将溶剂蒸干，得到粗制磨木木素。最后按秦特夫（1999）报道的方法对粗制磨木木素进行提纯得到精制磨木木素样品。
2.2.3 磨木木素的乙酰化处理将100mg磨木木素样品溶于2mL吡啶与乙酸酐（1：1）混合溶剂中，在反应瓶中充入氮气保护，在黑暗处室温下放置72h。之后，将反应物滴入乙醚产生沉淀，用离心机将沉淀物分离，再用乙醚洗涤沉淀物6至8次，直至没有吡啶的气味。最后得到完全乙酰化的磨木木素(秦特夫，2001)。
2.3 磨木木素的结构分析
2.3.1 傅立叶变换红外光谱分析（FTIR）用KBr压片法，将磨木木素样品在Nicolet 5DXC型傅立叶变换红外光谱仪上进行测定。其分辨率为4cm-1，扫描次数为30。
2.3.2 氢质子核磁共振光谱分析（1HNMR）将经过乙酰化处理的磨木木素样品溶解在氘代氯仿（CDCl3）中，用四甲基硅烷（TMS）做内标，用Bruker公司AV600高分辨液体核磁共振波谱仪，在600MHz条件下进行测定。
2.3.3 凝胶渗透色谱分析（GPC）将经过乙酰化处理的磨木木素样品溶解在四氢呋喃（THF）中。以聚苯乙烯（PS）为标准样品，用Waters 公司的515-2410型凝胶渗透色谱仪进行分析。色谱柱由Waters Styragel 3支串联，透过极限分别为106 nm，105 nm，104 nm。流动相为四氢呋喃，流速1mL•min-1，检测器温度30℃，进样体积100μl，分子量测定范围500-3,000,000。
3 结果(Results)
3.1 红外光谱特征
碱处理前后稻草中磨木木素的红外光谱见图1。
从图1中可以看出，稻草经6% 氢氧化钠预处理后，2931-2933cm-1处表征饱和亚甲基伸缩振动的吸收峰有所减弱；1718cm-1处表征非共轭羰基C=O伸缩振动的吸收峰消失；1601-1606cm-1处表征芳香核伸缩振动的吸收峰增强；1359cm-1处表征酚羟基伸缩振动的吸收峰消失；1265cm-1处表征愈创木基环甲氧基伸缩振动的吸收峰减弱(Marques等，2006)；1167cm-1处表征酯键中C-O-C伸缩振动的吸收峰消失（Xiao等，2001）；1124-1126cm-1处表征紫丁香环伸缩振动的吸收峰减弱；1045cm-1处表征愈创木酚O-H伸缩振动的吸收峰消失；1036cm-1处表征芳环在C-H面内变形振动的吸收峰出现。这说明稻草经氢氧化钠处理后，木素结构受到一定程度的破坏，部分官能团如羟基、亚甲基、甲氧基、酯键等被断裂，同时芳构化成分增多，尤其是取代芳香结构增多（黄丹莲等，2005）。

Fig. 1 Fourier transform infrared (FT-IR) spectra of MWL preparations extracted from untreated (spectrum a) and 6% NaOH-pretreated rice straw (spectrum b)
3.2 氢质子核磁共振波谱（1HNMR）特征
未处理稻草与经6%NaOH处理后稻草中磨木木素的1HNMR谱图见图2与图3。

Fig. 2 Hydrogen-1 nuclear magnetic resonance spectroscopy (1H-NMR) spectrum of MWL extracted from untreated rice straw

Fig. 3 Hydrogen-1 nuclear magnetic resonance spectroscopy (1H-NMR) spectrum of MWL extracted from 6% NaOH-pretreated rice straw

3.2.1 木素单元间连接键变化情况从图2和图3中可以看出，位移4.5ppm处表征的是β-O-4结构中的α位H质子和β位H质子，位移3.5ppm处表征的是β-5和β-β结构中的γ位H质子。碱处理后，这两个信号均消失，表明稻草木素中各结构单元间的β-O-4、β-5和β-β这三种连接键在碱处理过程中发生断裂(Jahan等，2007)（见图4）。

Fig. 4 The links of lignin structure
3.2.2 羟基含量变化情况木素样品中酚羟基与醇羟基的比例可以由芳香族醋酸酯的质子与脂肪族醋酸酯的质子的比值推算出来(Xu等，2006)。经计算未处理稻草的木素中酚羟基与醇羟基的比例为0.44，即酚羟基占总羟基数的30%，醇羟基占总羟基数的70%。碱处理后稻草的木素中酚羟基与醇羟基的比例为0.28，即酚羟基占总羟基数的22%，醇羟基占总羟基数的78%。碱预处理后，木素中酚羟基所占的比例减少。这与红外光谱的分析结果一致。由于酚羟基是比较活泼的基团，它容易与氢氧化钠发生反应。碱处理后酚羟基含量减少，表明木素结构得到降解。
3.3.3 芳香环结构未处理和碱处理后的木素均在位移7.7ppm，6.9ppm和6.6ppm处出现有比较强的信号，它们分别代表对羟基苯基苯环（H）上的质子，愈创木基苯环（G）上的质子和紫丁香基苯环（S）上的质子（任世学等，2005）。此现象表明，碱处理前后，木素的基本构型都没有改变，仍为GSH型。
3.3 分子量分布结果
未处理稻草与6% NaOH处理后稻草中磨木木素的分子量与分子量分布如图5所示。
由图5可以看出，稻草经6% NaOH处理后，木素结构发生了变化，由一个分子量分布变成三个分子量分布。每个分布的平均分子量有了很大程度的降低。虽然经6%NaOH处理后，木素中有一个分布的数均分子量比未处理木素的数均分子量要高，这可能是由于在碱的介质中，部分木素分子发生了缩合反应。但是经过碱处理后，木素的多分散性均大幅度降低，从最初的3.53下降为1.62，1.09与1.03（表1）。据文献值记载（蒋挺大，2001），分散性大于2的分子为三维网状结构，一般直链结构的分散性在2以下。这说明稻草经6% NaOH处理后，木素结构单元及结构单元之间的联接被打断，木素成分由一个复杂的三维网状分子断裂为三个具有直链结构的较小分子，从而将包裹其中的纤维素释放出来，使得厌氧微生物能够接触到更多的纤维素和对其进行更容易的消化，进而使厌氧消化产气量得到提高。

Fig. 5 Molecular weight distribution curves of MWL extracted from untreated （Fig.A） and 6% NaOH-treated（Fig.B） rice straw
表1 两种磨木木素的数均分子量、重均分子量与多分散性结果
Table 1 Weight-average (Mw) and number-average (Mn) molecular weights and polydispersity (Mw / Mn) of the two MWL preparations

4 讨论（Discussion）
由上述的分析结果可以看出，NaOH固态预处理使稻草中木素的形态结构发生了明显的变化，这些变化主要体现在木素内部结构、木素-碳水化合物复合体的形态结构两方面。
4.1 木素内部结构的变化情况
木素分子中存在有多种功能基，如羰基，羟基、甲氧基等。它们的性质活泼，在碱处理稻草的过程中，容易发生变化。
4.1.1羰基的变化由木素的化学结构已知，木素的羰基（C=O）主要存在于结构单元的侧链上。其中一部分为醛基，位于结构单元的γ-碳原子上；另一部分为酮基，位于侧链的β-碳原子上。从图1中可以看出，与未处理样的木素相比，稻草经过6％氢氧化钠的处理，木素侧链上的羰基已受分解而消失(池玉杰，2005)。
4.1.2 羟基的变化羟基是木素中的重要功能团之一。按其存在的状态可分为两种类型，一种是存在于木素结构单元苯环上的酚羟基（如图6中的Ⅰ），另一种是存在于木素结构单元侧链上的脂肪族羟基（如图6中的Ⅱ）。

Fig. 6 Hydroxyls in phenyl and side chain of lignin structure
由图1中可以看出，稻草经过6％ NaOH处理后，木素结构中的酚羟基消失。这说明木素结构中的一部分游离酚羟基（显弱酸性）与氢氧化钠（强碱）发生了化学反应，生成了钠盐。其反应式如图7所示：

Fig. 7 Sketch map of lignin reacting with NaOH
4.1.3 甲氧基的变化甲氧基是木素最有特征的功能基。它主要是联接在芳香环上而不是联接在脂肪族的侧链上。从图1中可以看出，稻草经6% NaOH处理后，甲氧基含量减少，为未处理稻草中甲氧基含量的74%。
在木素结构中，氧原子和苯环由于电子云的重叠而形成Pπ共轭体系，氧原子的电子云偏向苯环，导致甲基上的电子云也偏向氧原子一方，于是，在甲基的碳原子上形成正电的中心，易被亲核试剂OH-离子所进攻，发生亲核取代反应，并使OH-连接于碳原子上。连上的羟基上的氧原子的电子云亦向碳原子偏移，使甲氧基中氧和碳原子间的作用削弱而脱出甲基，形成新的酚羟基，而脱出的甲基形成甲醇。从而引起木素中甲氧基含量的减少。具体的反应过程见图8（詹怀宇，2005）：

Fig. 8 Sketch map of methoxyl separating from lignin structure
4.2 木素-碳水化合物复合体的变化
在草本木素的结构中，木素并不是简单地沉积在细胞壁聚糖（碳水化合物）之间，而是通过化学键与纤维素、半纤维素进行联接，构成木素—碳水化合物复合体的（Lignin—Carbohydrate Complex，简称LCC）。在木素与碳水化合物连接的各种化学键如α-醚键，苯基糖苷键，缩醛键和酯键等中，只有酯键对碱是非常敏感的。它是由葡萄糖醛酸的羧基与木素结构单元侧链上的羟基结合生成的。这种酯键即使是在温和的碱处理条件下，也容易发生水解，生成醇和羧酸。由图1中可以看出，碱处理后，稻草木素中表征酯键伸缩振动的特征吸收峰消失。这说明，在氢氧化钠的作用下，木素与碳水化合物之间的酯键断裂（见图9）（杨淑蕙，2001），从而将纤维素从木素的包裹中释放出来，增加了与厌氧菌反应的能力。

Fig. 9 Sketch map of lignin-carbohydrate complex reacting with NaOH
5. 结论(Conclusions)
NaOH固态预处理使稻草中木素的内部结构、木素-碳水化合物复合体的形态结构发生了明显的变化，这些变化表现在：（1)氢氧化钠固态预处理可以破坏木素的形态结构，使得部分官能团如羰基、羟基、甲氧基等发生不同程度的裂解，使结构单元间β-O-4、β-5和β-β等联接键断裂，因而将难降解的三维网状大分子物质切断成易降解的具有直链结构的小分子物质；（2)氢氧化钠可以使木素-碳水化合物复合体中的酯键发生断裂，将纤维素从木素的包裹中释放出来。正是由于这些变化，使得厌氧微生物能够接触到更多的纤维素和对其进行更有效的消化，从而使厌氧消化产气量得到提高。

通讯作者简介：李秀金（1964-），博士，教授，博士生导师，主要从事固体废物处理与资源化研究。近年来在国内外重要刊物上发表学术论文80多篇，被SCI收录20多篇，发表著作两部，申请和获授权发明专利5项。曾主持和参与了美国环保署、加州能源委员会和我国农业部、科技部和教育部的20多项科研课题。E-mail:xjli@mail.buct.edu.cn.

References:
Ren Z J, Gu M D. 2005. Integrated utilization of the crop straws in China and the development of cycle economy [J].Journal of Anhui Agri. Sci, 33 (11): 2105-2106 (in Chinese)
Wu J, Xu L J, Xie J L. 2006. The effect of alkali-pretreatment on anaerobic digestion of solid organic waste [J]. Acta Scientiae Circumstantiae, 26(2): 252-255 (in Chinese)
Ghosh S, Vieitez E R, Liu T. 1999. Biogasification of solid wastes by two-phase anaerobic digestion [J]. Biomass and Bioenergy, 16: 299-309
Yang D Y, Li X J. 2003. Improving biogas production of corn stalk through chemical and biological pretreatment: a preliminary comparison study [J]. Transactions of CSAE, 19(5): 209-211
Luo, Q M, Li. X J. 2005. Anaerobic biogasification of NaOH-treated corn stalk [J]. Transactions of CSAE, 21(2): 111-115
Shi Y, Dai C C, Wu Y C, et al. 2004. Study on the degradation of wheat straw by endophytic fungi [J]. Acta Scientiae Circumstantiae, 24(1):144-149 (in Chinese)
Björkman A. 1956. Studies on finely divided wood. Part I, Extraction of lignin with neutral solvents [J]. Svensk Papperstidning, 59: 477
Qin T F. 1999. The chemical structures and characteristics of the MWLs of Chinese fir (cunninghamia lanceolata) and poplar“sanbei”No.1 (populus nigra×P. simonii) wood[J]. Scientia Silvae Sinicae, 35 (3): 69-75 (in Chinese)
Qin T F. 2001. Study on FTIR, 1H and 13C NMR characterization of poplar I-214 heartwood and sapwood lignins[J].Forest Research, 14(4): 375-382 (in Chinese)
Marques A V, Pereira H, Rodrigues J, et al. 2006. Isolation and comparative characterization of a Björkman lignin from the saponified cork of Douglas-fir bark [J]. Journal of Analytical and Applied Pyrolysis, 77: 169-176
Xiao B, Sun X F, Sun R C. 2001. Chemical, structural, and thermal characterizations of alkali-soluble lignins and hemicelluloses, and cellulose from maize stems, rye straw, and rice straw [J]. Polymer Degradation and Stability, 74: 307-319
Huang D L, Zeng G M, Huang G H, et al. 2005. Optimum conditions of solid-state fermentation for white-rot fungi and for its degrading straw [J]. Acta Scientiae Circumstantiae, 25(2): 232-237 (in Chinese)
Jahan M S, Nasima D A, Islam M K, et al. 2007. Characterization of lignin isolated from some nonwood available in Bangladesh [J]. Bioresource Technology, (98): 465-469
Xu Q H, Qin M H, Shi S L, et al. 2006. Structural changes in lignin during the deinking of old newsprint with laccase-violuric acid system [J]. Enzyme and Microbial Technology, 39: 969-975
Ren S X. Fang G Z. 2005. Effects of ultrasonic processing on structure of alkali lignin of wheat-straw[J]. Chemistry and Industry of Forest Products, 25(supplement): 82-86(in Chinese)
Jiang T D. 2001. Lignin [M]. Beijing: Chemical Industry Press, 36(in Chinese)
Chi Y J.2005. FTIR analysis on function groups of David poplar wood and lignin degraded by 6 species of wood white-rot fungi. Scientia Silvae Sinicae,41（2）: 136-140(in Chinese)
Zhan H Y.2005. Fiber Chemistry and Physics [M].Beijing: Science Press, 287(in Chinese)
Yang S H. 2001. Plant fiber Chemistry [M]. Beijing: China Light Industry Press, 116-117（in Chinese）

中文参考文献;
任仲杰，顾孟迪. 2005.我国农作物秸秆综合利用与循环经济[J]. 安徽农业科学，33（11）：2105-2106
吴江，徐龙君，谢金连. 2006. 碱浸泡预处理对固体有机物厌氧消化的影响研究[J] .环境科学学报，26（2）：252-255
史央，戴传超，吴耀春，袁志林. 2004. 植物体内生真菌强化还田秸秆降解的研究[J]. 环境科学学报，24（1）：144-149
秦特夫. 1999. 杉木和“三北”一号杨磨木木质素化学官能团特征的研究[J]. 林业科学，35（3）：69-75
秦特夫. 2001.“I-214杨”心材、边材木质素的红外光谱、质子和碳-13核磁共振波谱特征研究[J]. 林业科学研究，14（4）：375-382
黄丹莲，曾光明，黄国和，等. 2005. 白腐菌固态发酵条件最优化及其降解植物生物质的研究[J].环境科学学报，25（2）：232-237
任世学，方桂珍. 2005. 超声波处理对麦草碱木质素结构特性的影响 [J]. 林产化学与工业，25（增刊）：82-86
蒋挺大编著. 2001. 木质素 [M]. 北京：化学工业出版社，36
池玉杰. 2005.6种白腐菌腐朽后的山杨木材和木质素官能团变化的红外光谱分析[J]. 林业科学，41（2）：136-140
詹怀宇主编. 2005. 纤维化学与物理 [M]. 北京：科学出版社, 287